【資料圖】

在一定的色譜操作條件下，色譜柱的柱效可用理論塔板數(shù)或理論塔板高度來(lái)衡量。一般說(shuō)來(lái)塔板數(shù)愈多，或塔板高度愈小，色譜柱的分離效能愈好。我們來(lái)通過(guò)實(shí)驗(yàn)告訴大家柱效是如何進(jìn)行評(píng)價(jià)的。

如何對(duì)柱效進(jìn)行評(píng)價(jià)？

1、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 儀器：高效液相色譜儀（帶自動(dòng)進(jìn)樣器，或配置微量進(jìn)樣器）、分析天平。 試劑：苯、萘、聯(lián)苯（均為分析純）、甲醇（色譜純）、純凈水。 2、實(shí)驗(yàn)步驟 色譜條件：色譜柱：C18，4.6×150mm，5μm；流動(dòng)相：甲醇-水（80：20，v/v）； 檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流速：1mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。 3、操作步驟 （1）分別精密配制含苯、萘、聯(lián)苯濃度均為約1mg·mL-1的3份對(duì)照品溶液各10mL。 （2）分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各2mL置于10mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋?zhuān)⒍ㄈ葜量潭龋瑩u勻，得到含苯、萘、聯(lián)苯的混合對(duì)照品溶液。 （3）按照上述色譜條件操作，進(jìn)樣，記錄色譜圖。 計(jì)算各色譜峰的理論塔板數(shù)及各峰間分離度。

如何提高HPLC柱效？

要提高液相色譜的效率可從以下幾方面入手。以下介紹了幾種國(guó)際上流行的測(cè)量和計(jì)算柱效值的方法。 1、提高液相色譜柱柱效的方法 （1）降低移動(dòng)相的流速，但會(huì)使分析時(shí)間延長(zhǎng)。 （2）減少固定相的量，但色譜柱中樣品的負(fù)載量也隨之減小。 （3）減小固定相的顆粒度，但不能過(guò)分，過(guò)分后色譜柱的滲透率也會(huì)減小。 （4）選用低粘度的移動(dòng)相，以利于快速傳質(zhì)，但卻不利于多組份分析。 （5）適當(dāng)提高柱溫，可降低移動(dòng)相的粘度，但柱效和分離度也隨之降低。 （6）盡量減小停滯移動(dòng)相的體積，但卻加快了移動(dòng)相的流速。 從以上介紹可看出，在色譜分析過(guò)程中，各種因素是互相聯(lián)系和制約的。只有通過(guò)對(duì)柱效值的跟蹤測(cè)算，對(duì)自己分析方法不斷的研究和實(shí)踐，才能找到最佳的工作條件。 2、對(duì)柱效值進(jìn)行跟蹤測(cè)算應(yīng)注意的問(wèn)題 我們也應(yīng)記住柱效值并不足以預(yù)測(cè)在所有條件下的柱性能，對(duì)大多數(shù)色譜工作者來(lái)說(shuō)，柱性能指的是色譜柱用于特定分離的能力，而僅僅有高柱效并不能保證這種分離能力。 不管用什么特定的測(cè)試方法，都會(huì)有幾個(gè)參數(shù)影響柱效的測(cè)定。這些參數(shù)包括：洗脫液的成分和粘度及其線流速，測(cè)定塔板數(shù)所用的溶質(zhì)、溫度、柱長(zhǎng)、填料裝填方式、顆粒度，還有所選用的測(cè)量和計(jì)算方法。而測(cè)量和計(jì)算方法對(duì)柱效值的確定起著極大的作用。 3、幾種測(cè)量和計(jì)算柱效值的方法 因?yàn)樯V峰是假定樣品濃度在移動(dòng)相和固定相中呈正態(tài)分布而得到的樣品譜帶分布,故常常把色譜峰型看作正態(tài)曲線來(lái)計(jì)算理論塔板數(shù)。因此計(jì)算柱效（以理論塔板數(shù)n為單位）的公式習(xí)慣上定義為： 式中tR為色譜峰的保留時(shí)間;σ2是以時(shí)間為單位測(cè)量色譜峰的偏差;a是和峰高（從測(cè)峰寬的基線量起）有關(guān)的常數(shù),ωb是峰寬,表示由色譜峰頂點(diǎn)與色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)處做切線與峰底基線相交兩點(diǎn)間的距離。 4、結(jié)論 假如一個(gè)色譜峰真是正態(tài)峰型，那么每種計(jì)算方法都會(huì)得到同樣的結(jié)果。然而即使一些比較理想的儀器和傾向于得到對(duì)稱(chēng)峰型的溶質(zhì)，由于柱內(nèi)的槽或空隙，也會(huì)出現(xiàn)非正態(tài)峰型。所以不同的計(jì)算方法將會(huì)得到相差較大的n值。通常偏離正態(tài)模型的峰型表示為“前延”或“拖尾”。對(duì)于這些峰型，越在峰的高處測(cè)量，計(jì)算的理論塔板數(shù)值就越大（準(zhǔn)確性越低）。 在許多情況下，色譜工作者需要能反映整個(gè)峰型（包括拖尾）的柱效值,同時(shí)為了保證定量的重復(fù)性，也需要色譜峰很好的對(duì)稱(chēng)性。這時(shí)對(duì)色譜峰非對(duì)稱(chēng)性最敏感的計(jì)算方法最適合。如果目的僅僅是要監(jiān)測(cè)色譜柱從第一次使用到使用壽命結(jié)束這一過(guò)程中的柱效，那么以上任何一種方法都可以,應(yīng)選擇最簡(jiǎn)便的方法。

如何提高氣相色譜柱柱效？

在實(shí)際工作中，我們通過(guò)對(duì)載氣流速、進(jìn)樣技術(shù)、氣化室溫度、色譜柱、柱溫、檢測(cè)器溫度這六個(gè)方面的選擇，有效地提高了柱效率，使分析出的色譜峰峰形正常，無(wú)峰形擴(kuò)張、拖尾、峰漏檢等不良現(xiàn)象出現(xiàn)，分離度高，從而提高了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。 所為柱效就是在較短的時(shí)間內(nèi)，用較短的柱子達(dá)到滿(mǎn)意的分析結(jié)果。為了提高色譜柱的柱效率，減少色譜峰擴(kuò)張、拖尾及峰漏檢等現(xiàn)象，在實(shí)際工作中，我們從以下六個(gè)方面入手，對(duì)柱操作條件的選擇進(jìn)行了探討。 1、載氣流速的選擇 氣相色譜最常用的載氣是：氫氣、氮?dú)狻鍤狻⒑狻?由速率理論可知，載氣流速慢有利于傳質(zhì)，有利于組分的分離，但分析時(shí)間會(huì)加長(zhǎng)；如果載氣流速快有利于加快分析速度，減少分了擴(kuò)散，但分離度降低。有時(shí)為了縮短分析時(shí)間，加大流量，但此時(shí)分離效果并不好。可見(jiàn)載氣流速的快慢都會(huì)降低柱效。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于一般色譜儀而言，載氣流量為20-100ml/min。 目前我們分析液化氣用的是熱導(dǎo)檢測(cè)器，載氣用的是氫氣，其流量控制是30 ml/min。分析戊烷發(fā)泡劑用的是氫火焰離子化檢測(cè)器，載氣用的是氮?dú)狻⑷紵龤鈿錃夂脱鯕猓@三種氣體的體積比是氮?dú)猓簹錃猓貉鯕鉃?：1：10，分析效果都是較好的。 2、進(jìn)樣技術(shù)的選擇 在氣相色譜分析中，一般采用注射器或六通閥門(mén)進(jìn)樣。在考慮進(jìn)樣技術(shù)的時(shí)候，以注射器進(jìn)樣為主來(lái)研究。 進(jìn)樣量：如果在進(jìn)樣過(guò)程中進(jìn)樣量大會(huì)導(dǎo)致：分離度小；保留值變化難于定性；峰高和峰面積與進(jìn)樣量不成線性關(guān)系，不能定量。進(jìn)樣量與氣化溫度、柱容量和儀器的線性響應(yīng)范圍等因素有關(guān)。進(jìn)樣量應(yīng)控制在瞬間氣化，達(dá)到規(guī)定分離要求和線性響應(yīng)的允許范圍內(nèi)。 填充柱沖洗法的瞬間進(jìn)樣量：液體樣品或固體樣品溶液一般為0.01～10μl，氣體樣品一般為0.11～10ml,在定量分析中,應(yīng)注意進(jìn)樣量讀數(shù)準(zhǔn)確。 注射器里空氣的排除：用微量注射器抽取液體樣品，只要重復(fù)地把液體抽入注射器又迅速把其排回樣品瓶，就可以將空氣排除。還有一種更好的方法，那就是用計(jì)劃注射量的約2倍的樣品置換注射器3～5次，每次取到樣品后，垂直拿起注射器，針尖朝上，留在注射器里的空氣都應(yīng)當(dāng)跑到針管頂部，推進(jìn)注射器塞子，空氣就會(huì)全部被排掉。 保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確：用經(jīng)置換過(guò)的注射器取約計(jì)劃進(jìn)樣量2倍左右的樣品，垂直拿起注射器，針尖朝上，讓針穿過(guò)一層紗布，這樣可用紗布吸收從針尖排出的液體。推進(jìn)注射器塞子，直到讀出所需要的數(shù)值。用紗布擦干針尖。至此準(zhǔn)確的液體體積已經(jīng)測(cè)得，需要再抽若于空氣到注射器里。如果不慎推動(dòng)柱塞，空氣可以保護(hù)液體使之不被排走。 進(jìn)樣手法：雙手拿注射器。用一只手(通常是左手)扶針插入墊片，注射大體積樣品(即氣體樣品)或柱前壓力極高時(shí)，要防止從氣相色譜儀注樣器來(lái)的壓力把注射器活塞彈出(即用右手的大拇指按壓住活塞頂部)。讓針尖穿過(guò)墊片盡可能深的進(jìn)入進(jìn)樣口，壓下注射器活塞停留1秒鐘，然后盡可能快而穩(wěn)地抽出針尖（抽出的同時(shí)繼續(xù)壓住注射器活塞)。 進(jìn)樣時(shí)間：進(jìn)樣時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)柱效率影響很大。若進(jìn)樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，遇使色譜區(qū)域加寬而降低柱效率。因此，對(duì)于沖洗法色譜而言，進(jìn)樣時(shí)間越短越好，一般必須小于1秒鐘。 3、氣化室溫度的選擇 氣化室溫度取決于樣品的化學(xué)和熱穩(wěn)定性、沸程范圍、進(jìn)樣口類(lèi)型等。合適的氣化室溫度即能保持樣品瞬間完全氣化，又不引起樣品分解。溫度過(guò)低，氣化速度比較慢，使峰形不規(guī)則，出現(xiàn)平頭峰或伸舌峰；溫度過(guò)高使出峰數(shù)目變化，產(chǎn)生前延峰，甚至樣品分解。為選擇合適的氣化室溫度，在多次的進(jìn)樣中我們發(fā)現(xiàn)，氣化室溫度比柱溫高50-100℃或比樣品組分中最高沸點(diǎn)高50-70℃較為合適。溫度過(guò)高過(guò)低都會(huì)影響柱效。 網(wǎng)友支招： 一般柱效不好，先排除其他問(wèn)題，都沒(méi)有問(wèn)題的話(huà)就是柱子不行了。 如果柱子比較老，可以反過(guò)來(lái)小流速?zèng)_洗一下，我做過(guò)效果很好！（僅適用舊柱子啊，有點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)）。 把柱頭變色的填料挖掉，用同類(lèi)新的填料填充好，效果很好。 正向沖洗色譜柱、反向沖洗色譜柱、超聲清洗色譜柱篩板、如果是柱內(nèi)死體積增加則需更換新柱。 色譜柱是消耗品，理論來(lái)說(shuō)，柱效很低的色譜柱是沒(méi)得救的，但是有一招，也就是當(dāng)你發(fā)現(xiàn)色譜柱沒(méi)得救的時(shí)候可以用一下，就是反沖色譜柱，但是你要注意的是，流速不要設(shè)置太大，這樣的話(huà)還能再堅(jiān)持一會(huì)。如果這樣也沒(méi)用的話(huà)，你就重新買(mǎi)吧。 如果柱子真的很老舊了，就反相沖洗試試，可能還能用一段時(shí)間，但不會(huì)太久。在然后就只能換填料了，或換新的柱子。 我們前段時(shí)間也是柱效不好，其他都比較正常。后來(lái)把柱子重新活化了一下，柱效由原來(lái)的兩千升到四千多了。不過(guò)維持了一個(gè)月又不行了。

總結(jié)

第一柱子溫度能調(diào)高，第二可選柱子內(nèi)徑小。 第三柱外體積小更妙，第四使用超純的硅膠。 第五氘燈要選能量高，第六采用中空透光燈。 第七改變有機(jī)相比率，第八流動(dòng)相pH可鼓搗。 第九可把鍵合相選挑，第十改變有機(jī)添加劑。 十一改變流動(dòng)相配比，十二縮短檢測(cè)響應(yīng)時(shí)間。